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蛋白芯片的基本原理及技術研究現狀
發布時間： 2010/6/30 點擊次數： 1968次提 供 商： 研域（上海）化學試劑有限公司 資料大?。?/td> 圖片類型： 下載次數： 0 次 資料類型： 瀏覽次數： 1968 次 相關產品： 詳細介紹： 隨著分子生物學芯片技術研究工作的進一步深入開展，NDA芯片技術已經被逐漸應用于對生物樣品中的各種已知或未知的核酸序列表達的檢測和比較研究。但是，作為生物體細胞中實施化學反應功能成分的蛋白質，其相當部分與活性基因所表達的mRNA之間未能顯示出直接的關系，因此使作為高通量基因表達分析平臺的cDNA芯片技術的應用過程受到一定的限制。另外，由于蛋白質結構和構象方面的各種微小的化學變化均能引起活性或功能的改變，為了進一步揭示細胞內各種代謝過程與蛋白質之間的關系以及某些疾病發生的分子機理，必須對蛋白質的功能進行更深入的研究。隨著DNA芯片技術的不斷成熟以及基因研究所取得的令人矚目的成果，進一步推動了蛋白質功能的研究及其相關技術的發展，蛋白芯片技術也就應運而生。本文擬對蛋白芯片的基本原理、相應技術研究的概況和存在問題進行綜述。
1 蛋白芯片技術的基本原理
蛋白芯片技術的基本原理是將各種蛋白質有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測用的芯片，然后，用標記了特定熒光抗菌素體的蛋白質或其他成分與芯片作用，經漂將未能與芯片上的蛋白質互補結合的成分洗去，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術，測定芯片上各點的熒光強度，通過熒光強度分析蛋白質與蛋白質之間相互作用的關系，由此達到測定各種蛋白質功能的目的。為了實現這個目的，首先必須通過一定的方法將蛋白質固定于合適的體上，同時能夠維持蛋白質天然構象，也就是必須防止其變性以維持其原有特定的生物活性。另外，由于生物細胞中蛋白質的多樣性和功能的復雜性，開發和建立具有多樣品并行處理能力、能夠進行快速分析的高通量蛋白芯處技術將有利于簡化和加快蛋白質功能研究的進展。
2 蛋白芯片技術的研究現狀
在多年的蛋白芯片技術的研究過程中，研究者為了尋找合適的物質作為蛋白的載體進行了不懈的探索。例如日本學者Velev利用含有陽離子表面活性劑（HTAB）脂質體作為載體，通過戊二醛作用使其與一種鐵蛋白包裹外殼的成分結合組裝制備成為一種納米水平的裝配體，這種裝配體可以在適當的pH條件下，使鐵蛋白分子進入并固定于包裹外殼內面，形成蛋白質的載體。Adachi等利用某些固體表面或薄膜覆蓋上含有電解質的薄膜作為載體，可以將膠體蛋白質顆粒成分轉移至薄膜上形成蛋白芯片。Uetz等在分析啤酒酵母基因組序列全長度閱讀框架編碼各種蛋白質的相互作用的過程，使用不同孔數的平板作為載體，建立了約含有6000個酵母轉化株組成的平板蛋白芯片系統，平板上的每一個小孔中含有一個酵母轉化株，可以根據其活性功能區開放閱讀框架的編碼表達生成一種蛋白質，利用這個系統可以用于蛋白質功能的檢測和分析。Arenkov等利用聚丙烯酰胺凝膠板作為支持物，將蛋白樣品置于凝膠上，然后經過電泳分離，使其成為蛋白的陣列用于進一步的研究。zui近，哈佛大學蛋白芯片研究中心Gavin等利用制備DNA芯片的高精密度機械手的針狀點樣槍頭在只有顯微鏡載玻片一半大小的玻片上，制備了*張含有樣品點數為10800的蛋白芯片。這張芯片用已純化的蛋白，G按每點為1納升的點樣量點樣10799次，另一次用FRB（FK-BR12-rapamycin binding domain of FKBP-rapamycin-associated protein）點樣。為了確保不同分子量 的點樣蛋白質都能夠被固定在玻片上，他們首先在玻片表面涂上BSA,然后使用N,N’-二琥珀酰胺碳酸（N,N,-disuccinimidyl carbonate）激活BSA表面的賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸殘基成為BSA-NHS玻片，其作用是促進BSA與點樣蛋白質的結合而使蛋白質被固定于玻片上。在制備芯片過程中，為了保證被固定在載體上的蛋白質依然保持天然的構象和生物學活性，他們在蛋白質點樣的磷酸鹽緩沖液中加入40%的甘油，以防止因體的蒸發而造成的蛋白質變性。點樣后再經3h的溫浴并將零片浸泡于含有小牛血清蛋白（BSA）的緩沖液中，使芯片表面含有一層小牛血清蛋白，用于封閉與其他蛋白質產生非特異性結合的部位及在表面未參加反應的醛基。為了檢測芯片的應用，他們用不同熒光抗體分別標記能與蛋白G和FRB特異結合的IgG和FKBP12（12Kd FK506-binding protein）并作用于蛋白芯片，觀察這些蛋白質與蛋白芯片的相互作用，其結果清晰地顯示芯片上的蛋白G和單一的FRB點樣分別被標上藍色和紅色熒光。該實驗研究建立了蛋白質樣品微量點樣技術并使蛋白質固定于載體上時能夠保留原有的構象和生物學活性，這將為今后對蛋白質多樣品的并行研究或快速分析——為制備高通量功能檢測的蛋白芯片奠定了技術基礎。
3 蛋白芯片的應用研究
目前，學者們正在開展有關蛋白芯片技術應用的研究，Holt等利用蛋白芯片技術篩選能夠相互結合的特異抗體抗原成分，他們利用12種表達較強但尚未接觸任何抗原的抗體片段篩選含有27648種人胎腦蛋白的蛋白芯片，從中找出了4組高度特異性的抗原（蛋白）-抗體復合物，其中有3種抗體結合的蛋白質功能未明，但是由于表達水平都較低，說明這種抗原-抗體的結合技術是一種具有較高特異性和敏感性的篩選方法，可以用于高通量篩選分離各種不同的抗體成分，或檢測基因的表達和蛋白分子間的相互作用，這將有助于對某些疾?。ò[瘤）的發病分子機理的研究，以及協助尋找疾病診斷和治療的靶分子。根據蛋白芯片技術的基本原理，可以將不同的抗體固定于載體上成為抗體蛋白芯片，用于檢測不同組織產生的蛋白質。
Ge在蛋白質的相互作用的研究中，采用了一種通用的蛋白質芯片系統，該系統敏感有效，用途廣泛，可定量測定及重復使用，而且操作簡易。Gavin等應用蛋白芯片技術觀察代謝過程有關作用物和酶的相互作用關系。他們選擇三對沒的激酶-作用物系統，即依賴3’，5’-磷酸蛋白激酶-Kemptide; 酷蛋白激酶Ⅱ-蛋白質磷酸酶抑制因子2和p42促有絲分裂劑激活蛋白（MAP）激酶（ErK2）-E1K1,首先將各系統的作用物按順序固定于三張BSA-NHS玻片上，分別在有同位素γ-³³P ATP的環境中，與不同蛋白激酶溫浴，然后，玻片經用乳劑處理后可在光鏡下觀察到各種蛋白激酶催化特異的作用物產生磷酸化反應。其結果提示蛋白芯片技術可以應用于作用物與酶相互作用的研究及代謝機制的分析。Gavin等還在蛋白芯片技術研究過程通過DIG、生物素和合成的六氫吡喧酮胺（即AP1497）等三種具有對應的蛋白受體的小分子特質，研究蛋白的受體蛋白按順序固定的相互作用。他們首先將三種小分子物質的受體蛋白按順序固定于同一載體上并制備成為相同的四張蛋白芯片，將BSA分別用沒的熒光物質（Alexa488、Cy3，或Cy5）標記，并分與DIC、生物素和AP1497三種小分子物質結合成為探針，用每一種具有不同熒光標記的探針作用地芯片，結果只能有能與小分子對應的受體蛋白被標上熒光。上述結果說明使用的熒光劑之間沒有交叉的熒光激發和發光作用，因此，將三種標記探針混合后作用于蛋白芯片，則可使三種不同的受體蛋白同時標記上不同的熒光。研究結果提示蛋白芯片技術對于新藥的發掘是十分有用的，因為它對尋找新藥作用的靶點非常方便。
4 存在的問題及應用前景
雖然目前已經成功地制出了*張具有高通量分析平參作用的蛋白芯片，通過適當的技術處理可以使點樣蛋白保持天然的構象和生物學活性。但是，利用蛋白芯片技術對于蛋白質功能的研究仍然存在著種種問題，例如目前大多數來自于cD-NA文庫的克隆體系不能通過正確的閱讀框架編碼蛋白質;或者不能正確表達產生具有氨基酸全序列的蛋白分子；通過細菌表達的蛋白質不能形成正常的空間構象等，都將直接影響有關蛋白質功能的研究。另外，為了方便種類繁多的蛋白質的功能檢測和分析，通過不同途徑或方式獲取并用于制作蛋白芯片的蛋白質必須首先經過純化。正常和異常情況下蛋白質與蛋白質之間的相互作用的差別都需要我們進一步去探索。
綜上所述，高通量分析平臺蛋白芯片技術的建立將為蛋白質功能及其相關的研究提供快速、高信息量和更為直接的研究方法，與其他的分子生物學分析方法相比，蛋白芯片技術具有快速、平行的*性。該方法的建立和應用將有助于人類揭示疾病發生的分子機制及尋找更為合理有效的治療手段和途徑。迄今為止，這一嶄新的技術仍存在一些缺陷，有待進一步完善和發展。
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